A formação do coágulo de fibrina no sítio de lesão endotelial constitui processo crucial para a manutenção da integridade vascular. Os mecanismos operantes nesse processo são dependentes da integridade anatômica e funcional do sistema hemostático, e devem ser finamente regulados de modo a simultaneamente contrapor-se à perda excessiva de sangue e evitar a formação de trombos intravasculares decorrentes de formação excessiva de fibrina.
Os componentes do sistema hemostático incluem as plaquetas, os vasos, as proteínas da coagulação do sangue, os anticoagulantes naturais e o sistema de fibrinólise. O equilíbrio funcional desses diferentes “setores” da hemostasia é garantido por uma variedade de mecanismos envolvendo interações entre proteínas, respostas celulares complexas, e regulação de fluxo sangüíneo. No presente texto, abordaremos os sistemas de coagulação, anticoagulação e fibrinólise.
A formação do coágulo de fibrina envolve complexas interações entre proteases plasmáticas e seus cofatores, que culminam na gênese da enzima trombina (ou fator II ativado), que por proteólise converte o fibrinogênio solúvel em fibrina insolúvel. Nas últimas décadas, progressos expressivos ocorreram, no que concerne à compreensão da fisiologia desse sistema e dos mecanismos que o regulam. Conforme ressaltado abaixo, esses conhecimentos levaram a melhor compreensão da fisiologia da hemostasia e do papel das reações hemostáticas em doenças hemorrágicas e trombóticas.
Em 1964, Macfarlane e Davie & Ratnoff propuseram a hipótese da “cascata” para explicar a fisiologia da coagulação do sangue. Nesse modelo, a coagulação ocorre por meio de ativação proteolítica seqüencial de zimógenos por proteases plasmáticas, resultando na formação de trombina que então converte a molécula de fibrinogênio em fibrina. Esse modelo dividia a coagulação em uma via extrínseca (envolvendo componentes do sangue, mas também elementos que usualmente não estão presentes no espaço intravascular) e uma via intrínseca (iniciada por componentes presentes no intravascular), que convergem no ponto de ativação do fator X (“via final comum”). Na via extrínseca, o fator VII plasmático (na presença do seu cofator, o fator tecidual, também designado tromboplastina) ativa diretamente o fator X. Na via intrínseca, ativação do fator XII ocorre quando o sangue entra em contato com uma superfície contendo cargas elétricas negativas (por exemplo, a parede de um tubo de vidro). Esse processo é denominado “ativação por contato” e requer ainda a presença de outros componentes do plasma: pré-calicreína (uma serino-protease) e cininogênio de alto peso molecular (um cofator não enzimático). O fator XIIa ativa o fator XI, que por sua vez ativa o fator IX. O fator IXa, na presença de fator VIII, ativa o fator X da coagulação, desencadeando a geração de trombina e subseqüente formação de fibrina.
Não obstante haja a tradição de se dividir o sistema de coagulação do sangue em intrínseco e extrínseco, tal separação é atualmente entendida como inadequada para entendimento da fisiologia da coagulação, tendo em vista que a divisão (em intrínseco e extrínseco) não ocorre in vivo. Em adição, alterações conceituais ocorreram desde a descrição do modelo da cascata no que diz respeito à importância relativa das duas vias de ativação da coagulação. Por exemplo, a julgar pela gravidade das manifestações hemorrágicas decorrentes das deficiências dos “fatores intrínsecos” VIII e IX (Hemofilia A e B, respectivamente), postulou-se no passado que a via intrínseca teria maior relevância na fisiologia da coagulação. Contudo, essa idéia não é de todo correta: sabe-se que a deficiência de fator XI é associada a distúrbio hemorrágico leve, e deficiências dos fatores da ativação por contato (fator XII, pré-calicreína, cininogênio de alto peso molecular) não resultam em quadro hemorrágico. Os fatores intrínsecos portanto não têm importância primária na geração de fator IXa durante o processo hemostático normal que sucede a lesão vascular. Por outro lado, a deficiência de fator VII (crucial para a “ativação extrínseca” da coagulação do sangue) é associada a quadro hemorrágico similar à Hemofilia. Em conjunto, esses dados demonstram que a ativação do fator IX não depende exclusivamente da “via intrínseca” e indicam que a coagulação do sangue é iniciada principalmente pela via do fator tecidual (“extrínseca”). Adicionalmente, experimentos conduzidos nas últimas três décadas demonstraram que as vias intrínseca e extrínseca não exibem funcionamento independente, conforme detalhado a seguir.
Atualmente aceita-se que mecanismos hemostáticos fisiologicamente relevantes estejam associados com três complexos enzimáticos procoagulantes, os quais envolvem serino-proteases dependentes de vitamina K (fatores II, VII, IX e X) associadas a cofatores (V e VIII), todos localizados em uma superfície de membrana contendo fosfolipídeo.
Os diferentes componentes enzimáticos da coagulação convertem seus substratos (pro-cofatores) em cofatores, os quais localizam as proteases sobre as superfícies celulares contendo fosfolipídeos (em especial das plaquetas) em que essas reações acontecem. Os elementos biológicos que contribuem para o componente de fosfolipídeos da coagulação incluem tecidos vasculares lesados, células inflamatórias e plaquetas ativadas. Os principais contribuintes (considerando o número de sítios) são as membranas de plaquetas, as quais quando ativadas expressam sítios de ligação para os complexos fator IXa/fator VIIIa (complexo “tenase”) e fator Xa/fator Va (complexo “protrombinase”). Além disso, íons cálcio são necessários em diversos passos das reações da coagulação.
O início do processo de coagulação depende da exposição do sangue a componentes que normalmente não estão presentes no interior dos vasos, em decorrência de lesões estruturais (injúria vascular) ou alterações bioquímicas (por exemplo, liberação de citocinas). Qualquer que seja o evento desencadeante, o início da coagulação do sangue é dependente da expressão do seu componente crítico, o fator tecidual (FT), por células endoteliais e pelo monócito, e sua exposição ao espaço intravascular.
O FT é uma glicoproteína de membrana de 45000 Da que funciona como receptor para o fator VII da coagulação. O FT não é normalmente expresso em células em contato direto com o sangue (tais como células endoteliais e leucócitos), mas apresenta expressão constitutiva em fibroblastos subjacentes ao endotélio vascular. O FT é também encontrado em queratinócitos, células epiteliais do trato respiratório e trato gastro-intestinal, cérebro, células musculares cardíacas e glomérulos renais. Células endoteliais e monócitos, que normalmente não expressam o fator tecidual, podem expressá-lo na vigência de lesão endotelial e na presença de estímulos específicos tais como endotoxinas e citocinas (TNF-a e interleucina-1). Em indivíduos normais, níveis mínimos da forma ativada do fator VII da coagulação (FVIIa) estão presentes em circulação, correspondendo a aproximadamente 1% da concentração plasmática total de fator VII. O FVIIa é capaz de se ligar ao FT expresso em membranas celulares e exposição do FT ao plasma resulta na sua ligação ao FVII e FVIIa, sendo que somente o complexo FT-FVIIa exibe função enzimática ativa; o complexo é também capaz de ativar o FVII em processo denominado “auto-ativação”. O complexo FT-FVIIa tem como substratos principais o fator IX e o fator X, cuja clivagem resulta na formação de FIXa e FXa, respectivamente, com subseqüente formação de trombina e fibrina. Deve ser salientado que quantidades mínimas de trombina são geradas a partir do complexo “protrombinase” extrínseco. Entretanto, uma vez que há gênese inicial de trombina, esta enzima é capaz de ativar o fator V em fator Va, e o fator VIII em fator VIIIa. Essas duas reações envolvendo ativação de pro-cofatores são fundamentais para a geração do complexo “tenase” intrínseco (fator IXa/fatorVIIIa), o qual converte o fator X em fator Xa, e do complexo “protrombinase” (fator Va/fator Xa), que converte a protrombina em trombina. Outro aspecto importante dessas reações é que o complexo fator IXa/fator VIIIa ativa o fator X com eficiência 50 vezes maior que o complexo fator VIIa/FT. O produto principal dessas reações, a trombina (IIa), exibe atividades procoagulantes convertendo o fibrinogênio em fibrina, promovendo ativação plaquetária e ativando o fator XIII da coagulação, que por sua vez estabiliza o coágulo de fibrina.
A análise do conjunto de reações envolvidas na coagulação do sangue, à luz dos conceitos atuais sobre a fisiologia desses processos, mostra que não há distinção clara entre os sistemas intrínseco e extrínseco, que atuam de modo altamente interativo in vivo. Em condições fisiológicas, as reações da coagulação resultam em produção equilibrada de quantidades apropriadas de trombina e do coágulo de fibrina, em resposta adequada e proporcional à injúria vascular existente. De fato,, no estado fisiológico não há formação e deposição de fibrina no intravascular em decorrência das propriedades anticoagulantes do endotélio, à forma inativa das proteínas plasmáticas envolvidas na coagulação (que circulam como zimogênios ou cofatores), e à presença de inibidores fisiológicos da coagulação (vide infra). Por outro lado, a perda do equilíbrio dinâmico das reações da coagulação têm como conseqüência clínica o aparecimento de distúrbios hemorrágicos ou trombóticos.
Finalmente, vale mencionar que, no que se refere ao sistema de coagulação, a utilização dos termos “intrínseco” e “extrínseco” pode ser ainda útil na interpretação de dois exames laboratoriais utilizados na rotina da avaliação da hemostasia: o TP/INR e o TTPA, que são de particular importância no diagnóstico de anormalidades hemostáticas e na monitorização de terapêutica anticoagulante. Na execução desses testes in vitro, criam-se no tubo de reação as condições para ativação preferencial das vias ditas extrínseca (avaliada pelo TP) ou intrínseca (avaliada pelo TTPA). À parte da utilidade mencionada, de caráter puramente didático e de interpretação laboratorial, a divisão do sistema de coagulação em duas vias é inadequada para a compreensão da sua fisiologia. De fato, o conceito de que o fator tecidual é o principal ativador da coagulação do sangue e de que a distinção entre sistemas extrínseco e intrínseco não existe na fisiologia desse sistema representam importantes mudanças conceituais que devem ser assimiladas para entendimento correto dos eventos bioquímicos envolvidos na ativação do sistema hemostático.
Mecanismos reguladores da coagulação sangüínea
As reações bioquímicas da coagulação do sangue devem ser estritamente reguladas de modo a evitar ativação excessiva do sistema, formação inadequada de fibrina e oclusão vascular. Assim, a atividade das proteases operantes na ativação da coagulação é regulada por numerosas proteínas inibitórias que atuam como anticoagulantes naturais. No presente capítulo, discutiremos as que apresentam maior relevância biológica atuando como inibidores fisiológicos da coagulação: o TFPI (“tissue factor pathway inhibitor”), a proteína C (PC) e a proteína S (PS), e a antitrombina (AT).
Conforme mencionado, o complexo fator VIIa/FT atua sobre dois substratos principais: os fatores IX e X da coagulação, ativando-os. Essas reações são reguladas pelo inibidor da via do fator tecidual (TFPI), uma proteína produzida pelas células endoteliais que apresenta três domínios do tipo “Kunitz”. O primeiro domínio liga-se ao complexo fator VIIa/FT inibindo-o, e o segundo domínio liga-se e inibe o fator Xa. Assim, a ativação direta do fator X é regulada negativamente de modo rápido na presença do TFPI, que limita desta forma a produção de fator Xa e fator IXa. A ligação do fator Xa é necessária para que o TFPI exerça seu papel inibitório sobre o complexo fator VIIa/FT.
Outra importante via de anticoagulação do sangue é o sistema da PC ativada (PCa). A PC, quando ligada ao seu receptor no endotélio (EPCR, “endothelial PC receptor”), é ativada após a ligação da trombina ao receptor endotelial trombomodulina (TM). A PCa inibe a coagulação clivando e inativando os fatores Va e VIIIa. Este processo é potencializado pela PS, que atua como um cofator não enzimático nas reações de inativação. A identificação do sistema da PCa implicou importante mudança conceitual no que se refere ao papel da trombina no sistema hemostático: não obstante ela tenha função procoagulante quando gerada em excesso, sua função na fisiologia do sistema, em que é produzida apenas em pequenas quantidades, é de um potente anticoagulante, tendo em vista que sua ligação à TM endotelial representa o evento chave para ativação da via inibitória da PC.
A AT (anteriormente designada AT III) é o inibidor primário da trombina e também exerce efeito inibitório sobre diversas outras enzimas da coagulação, incluindo os fatores IXa, Xa, e XIa. Adicionalmente, a AT acelera a dissociação do complexo fator VIIa/fator tecidual e impede sua reassociação. Desta forma, a AT elimina qualquer atividade enzimática procoagulante excessiva ou indesejável. A molécula de heparan sulfato, uma proteoglicana presente na membrana das células endoteliais, acelera as reações catalisadas pela AT. A atividade inibitória da AT sobre a coagulação é também potentemente acelerada pela heparina, um polissacarídeo linear estruturalmente similar ao heparan sulfato.
As diferentes vias regulatórias citadas anteriormente não operam isoladamente, pois há sinergismo entre o TFPI e a AT e entre o TFPI e o sistema da PC suprimindo a gênese de trombina. Por exemplo, a AT (mas não o TFPI) inibe a ativação do fator VII mediada pelo fator Xa no complexo fator VII/FT. Por outro lado, o TFPI (mas não a AT) inibe o excesso de ativação do fator X pelo complexo fator VII/FT. Adicionalmente, o TFPI em conjunção com o sistema da PCa inibe potentemente a gênese de trombina pelo complexo fator VII/FT.
Em condições fisiológicas (ausência de lesão vascular) há predomínio dos mecanismos anticoagulantes sobre os procoagulantes, mantendo-se desta forma a fluidez do sangue e preservando-se a patência vascular.
Sistema plasminogênio/plasmina (sistema fibrinolítico)
Fibrinólise pode ser definida como a degradação da fibrina mediada pela plasmina. O sistema fibrinolítico ou sistema plasminogênio/plasmina é composto por diversas proteínas (proteases séricas e inibidores) que regulam a geração de plasmina, uma enzima ativa produzida a partir de uma pro-enzima inativa (plasminogênio) que tem por função degradar a fibrina e ativar metaloproteinases de matriz extracelular. À parte do seu papel no sistema hemostático, nos últimos anos foram descobertas numerosas funções do sistema plasminogênio/plasmina em outros processos, incluindo remodelagem da matriz extracelular, crescimento e disseminação tumoral, cicatrização e infecção, mas estes aspectos não serão aqui abordados.
As enzimas do sistema fibrinolítico são todas serino-proteases, ao passo que os inibidores da fibrinólise são membros da superfamília de proteínas designadas serpinas (inibidores de proteases séricas). São conhecidos dois ativadores fisiológicos do plasminogênio: o ativador do plasminogênio do tipo tecidual (t-PA, “tissue-type plasminogen activator”) e o ativador do plasminogênio do tipo uroquinase (u-PA, “urokinase-type plasminogen activator”). Os dois ativadores têm alta especificidade de ligação com seu substrato (plasminogênio) e promovem hidrólise de uma única ponte peptídica (Arg560-Val561) que resulta na formação de uma serino-protease ativa, a plasmina. Embora a plasmina degrade não somente a fibrina mas também o fibrinogênio, fator V e fator VIII, em condições fisiológicas a fibrinólise ocorre como processo que é altamente específico para a fibrina, portanto de ativação localizada e restrita, e não sistêmica, cumprindo desta forma sua função de remover o excesso de fibrina do intravascular de modo equilibrado. Esta especificidade dependente de fibrina é resultado de interações moleculares específicas entre os ativadores do plasminogênio, o plasminogênio, a fibrina, e os inibidores da fibrinólise. Por exemplo, o t-PA exibe baixa afinidade pelo plasminogênio na ausência de fibrina (KM = 65 mM), afinidade que é muito aumentada na presença de fibrina (KM = 0,15-1,5 mM). Isto ocorre porque a fibrina representa uma superfície ideal para ligação do t-PA ao plasminogênio, e nesta reação o plasminogênio liga-se à fibrina via resíduos de aminoácido lisina (“lysine-binding sites”). Em contraste com esses mecanismos fisiológicos, ativação mais extensa do sistema fibrinolítico ocorre quando da infusão de agentes trombolíticos do tipo estreptoquinase e uroquinase, que não são específicos para a presença de fibrina.
A inibição do sistema fibrinolítico ocorre em nível dos ativadores do plasminogênio mediante ação de inibidores específicos (PAIs, “plasminogen activator inhibitors”), cujo principal representante é o PAI-1, e diretamente sobre a plasmina, função inibitória esta exercida pela a2-antiplasmina.
Recentemente, um novo componente do sistema fibrinolítico foi identificado e designado TAFI (“thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor”, inibidor da fibrinólise ativado pela trombina, também denominado carboxipeptidase B plasmática, pro-carboxipeptidase U ou pro-carboxipeptidase R). O TAFI é um zimogênio plasmático que ocupa importante papel na hemostasia funcionando como um potente inibidor da fibrinólise. O TAFI é ativado pela trombina, tripsina e plasmina, e na sua forma ativada é capaz de inibir a fibrinólise por remover resíduos de lisina da molécula de fibrina durante o processo de lise do coágulo, suprimindo assim as propriedades de cofator da fibrina parcialmete degradada na ativação do plasminogênio. Curiosamente, a principal via de ativação do TAFI é dependente da ligação do fator IIa (trombina) à trombomodulina (complexo que tem também a função de ativar o sistema da proteína C). Desta forma, a molécula do TAFI representa um ponto de conexão entre os sistema de coagulação e fibrinolítico.
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